應(yīng)變率相關(guān)剛度測(cè)量

使用Piuma Chiaro納米壓痕系統(tǒng)（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）（26）測(cè)試天然心臟組織塊，具有不同剛度的PDMS底物以及PDMS底物上培養(yǎng)的CMF細(xì)胞的硬度。

使用直徑為90 μm的膠體探針測(cè)試具有不同剛度的PDMS基板。用于軟基板的壓痕探頭的彈簧常數(shù)為0.43 N/m，而用于中等和剛性基板的探頭的彈簧常數(shù)為4.21 N/m。針對(duì)每個(gè)PDMS底物條件測(cè)試了三個(gè)單獨(dú)的樣品，并從每個(gè)樣品的不同位置記錄了多個(gè)測(cè)量值。所有樣品共記錄了204-390個(gè)壓痕數(shù)據(jù)點(diǎn)。

用于在PDMS襯底上接種的CMF的壓痕探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別約為0.045 N / m和41 μm。針對(duì)每種底物類(lèi)型，在兩個(gè)獨(dú)立樣品上總共測(cè)試了45種不同的CMF細(xì)胞。在測(cè)試之前，懸臂的靈敏度校準(zhǔn)是通過(guò)壓痕硬表面（即載玻片）進(jìn)行的。使用的加載速度分別為 50、2 和 0.2 μm/s。開(kāi)發(fā)了一個(gè)定制的MATLAB代碼（The MathWorks，Natick，MA），以確定探針和樣品之間的接觸點(diǎn)，并使用赫茲接觸模型（27，33）識(shí)別樣品的楊氏模量：(1)$?=\frac{16}{9}?{?}^{1/2}{\delta }^{3/2},$其中F是施加的力，δ是壓痕深度，R是膠體探針的半徑，E是樣品的楊氏模量。假設(shè)樣品是不可壓縮的（即泊松比為0.5），因?yàn)槭褂迷撃Ｐ偷奈墨I(xiàn)研究得出的結(jié)論是，當(dāng)泊松比從20.0到3.0（5）變化時(shí)，測(cè)量的性質(zhì)變化小于34%，因此，假設(shè)大多數(shù)生物樣品的不可壓縮性是合理的（35，36).使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以95%置信水平報(bào)告統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。

收縮力測(cè)量

通過(guò)駐留實(shí)驗(yàn)（23）用納米壓痕儀測(cè)量細(xì)胞片內(nèi)單個(gè)CM和CMF的收縮力。簡(jiǎn)而言之，將納米壓痕探針與樣品接觸，并且探針的位移保持恒定（換句話說(shuō)，探針駐留在樣品上）30秒以動(dòng)態(tài)測(cè)量其偏轉(zhuǎn)，這與電池沿橫向相對(duì)于基板的收縮力成正比。

首先，我們測(cè)量了共培養(yǎng)樣品上與CM-CMF邊界相鄰的單個(gè)CM的收縮力，以及沒(méi)有任何CMF的對(duì)照樣品上CM-PDMS邊界處的CM。然后，依次測(cè)量單個(gè)CMF的收縮力，每次在距邊界更遠(yuǎn)的距離處測(cè)量，如圖1 A所示，直到?jīng)]有可檢測(cè)到的信號(hào)。所有跳動(dòng)力測(cè)量均在細(xì)胞核上進(jìn)行，以確保一致性，并盡量減少細(xì)胞剛度異質(zhì)性的影響。每次測(cè)量后，懸臂沿X軸移動(dòng)，并在最近的CMF上進(jìn)行測(cè)量。因此，所有測(cè)量都是在距邊界相似的距離處進(jìn)行的，根據(jù)最近CMF的確切位置，差異僅為～5-10%。所用探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別為0.067 N/m和5.4 μm。開(kāi)發(fā)了定制的 MATLAB 代碼來(lái)分離每個(gè)單拍并計(jì)算平均收縮力。

加載速度相關(guān)的機(jī)械性能

首先，我們通過(guò)納米壓痕實(shí)驗(yàn)研究了天然組織基質(zhì)、具有不同剛度的制備PDMS底物以及在這些基質(zhì)上接種的CMFs的粘彈性。我們觀察到不同PDMS基板的測(cè)量剛度的變化取決于壓痕的加載速度。PDMS基板剛度是在三種不同的加載速度（即50、2和0.2 μm/s）下測(cè)量的，如圖1 B所示。當(dāng)加載速度從50 m/s降低到2 μ m/s和從2 μm/s（p < 0.2）降低時(shí)，基體的剛度顯著降低，但軟基體的剛度從0 m/s降低到0001 μm/s（p = 50.2）時(shí)除外。同樣，在不同PDMS襯底上晶種的CMF表現(xiàn)出加載速度依賴(lài)性剛度（p <0.1484），當(dāng)加載速度從0 m/s降低到005.2 μm/s（p = 0.2）時(shí)，在中等襯底上接種的CMF除外（圖0 C）。為了進(jìn)行比較，測(cè)量了天然大鼠心臟組織的硬度，該硬度也隨著加載速度從1924降低到1.50 μm / s（p < 0.2）而降低。

PDMS襯底和在PDMS襯底上晶種的CMF均表現(xiàn)出應(yīng)變速率依賴(lài)性剛度。軟底物剛度約為13.9-17.66 kPa，與天然健康心臟組織的硬度相似（即11.33-18.46 kPa （6）），因?yàn)槲覀儨y(cè)量的健康成年大鼠心臟為13.32±8.60 kPa，而中度和僵硬底物的硬度分別為83.29-105.71和483.92-529.63 kPa，與早期研究中測(cè)量的梗死心臟組織的硬度相當(dāng)（4， 5）. 同樣，在軟、中和硬基底上接種的 CMF 的剛度分別為 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa?？梢钥闯?，正如預(yù)期的那樣，電池剛度隨著基板剛度的增加而增加（44）。這種加載速度依賴(lài)性剛度與先前在組織和細(xì)胞（上的發(fā)現(xiàn)一致33，45）。